在真核细胞中，有着多种不同的分子途径来确保细胞质、内质网、以及线粒体中的蛋白质有正常的折叠完整性，这些分子信号能够以特定的方式去感知未折叠蛋白的存在并向细胞核内发出信号，以此来激活那些可以调控未折叠蛋白反应（UPR）的基因的表达，这一分子调控机制对于维持细胞内蛋白质稳态有着十分重要的意义。线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response, mtUPR）是指线粒体为了维持其蛋白质平衡，启动由DNA 编码的线粒体热休克蛋白和蛋白酶等基因群转录活化程序的应激反应。近几年来，mtUPR也逐渐进入研究者的视线，被认为是线粒体质量调控的重要环节之一。由蛋白酶 ClpP 以及它的复合体 ClpX 调控的 mtUPR的过程在普通真核细胞中已有研究报道，然而这一对复合体蛋白在生殖细胞发育过程中的作用以及分子机制还存在大量未知。

　　2023年10月5日，香港大学深圳医院，生殖医学重点实验室王天任课题组在Communications Biology上在线发表了题为”ClpP/ClpX deficiency impairs mitochondrial functions and mTORC1 signaling during spermatogenesis”的研究。该研究通过分别构建ClpP和ClpX的条件性敲除小鼠模型，在小鼠的生殖细胞中分别敲除ClpP和ClpX后，发现雄性小鼠的睾丸组织均显著减小，其内部结构出现剧烈改变，生殖细胞因线粒体形态及功能发生紊乱从而发生大规模凋亡，造成细胞数量大规模丢失。不难猜想，这些cKO小鼠的生殖细胞无法顺利进行减数分裂，最终导致精子生成障碍。

　　通过切片和免疫荧光染色，能够观察到在这一时期的睾丸组织中，对照组的小鼠已经可以观察到比较后期的圆形精子细胞，甚至可以通过DAPI染色观察到有条形精子的出现，然而在ClpP或ClpX敲除的小鼠组织中，生殖细胞减数分裂阻滞在了减一前期，减数分裂的细胞不能成功进入到粗线期（Pachytene），表现为γH2A.X信号仍然残留在全部的常染色体中，而没有聚集在XY性染色体。

　　通过进一步染色体铺片的方式去做免疫荧光染色分析，发现Clpp或者Clpx基因缺失的精母细胞，不能成功从zygotene时期进入到pachytene时期，表现为DNA双链破裂信号在pachytene时期错误分布，常染色体联会不完全，以及cross-over没有正常进行（表现为MLH1信号在pachytene中后期还未有染色体上的正常表达）。

　　通过对睾丸组织的切片进行扫描电镜的分析，发现Clpp或Clpx敲除后的生殖细胞中，线粒体已经不能够行成长条形的处于激活期线粒体的形态，而是多为圆形的，内外膜出现严重形态紊乱的线粒体分布。ClpX敲除组中，线粒体呈现出空泡状的结构，可能引起了一定程度的线粒体自噬反应。

　　通过JC-1染色去测试线粒体膜电位，以及细胞ROS水平恢复情况试验可以观测出，与对照组精母细胞相比，ClpP或者ClpX敲除后的精母细胞中，线粒体膜电位及线粒体功能已经出现紊乱。

　　线粒体功能的减弱进而导致生殖细胞在减数分裂中供能不足，致使减数分裂的一些微活动进程受阻，表现为染色体端粒脱离核膜，alpha-tubulin微丝蛋白表达异常等。这也进一步导致这些线粒体受损的生殖细胞走向凋亡。

　　之后，该研究团队将睾丸组织细胞裂解成单细胞后，利用BSA梯度密度沉降的方法，将处于pachytene时期的生殖细胞分离出来，按组别送了RNA-seq以及m6A-seq，通过转录组学和甲基化测序相互联动分析，发现代谢类的通路及mTOR通路变化最为显著。将这些分离出的细胞进行western blot分析，发现mTORC1信号的两大底物，p70 S6K和S6均发生过度的磷酸化激活，表示mTORC1通路在ClpP或ClpX敲除的生殖细胞中出现过度激活。

　　在敲除组的小鼠中，利用in vivo注射雷帕霉素的方式，从出生后2周开始药物注射治疗，每间隔一天注射一次，注射两周后发现能够成功抑制cKO动物生殖细胞中的mTORC1通路, 利用生理学切片染色观查发现，出生后一个月的小鼠testis组织中甚至可以观测到处于减数分裂后期的圆形精细胞以及条形精细胞，表示该方法能够起到部分挽救效果，通过调控mTORC1通路的磷酸化水平，从而去帮助恢复减数分裂的进行及精子发生进程。

　　综上所述，该研究利用构建条件性敲除的小鼠模型，充分展示了ClpP和ClpX在精子发生进程中的重要性，这一对复合体蛋白对维持雄性生殖细胞中正常的线粒体形态和功能至关重要。ClpP 或ClpX 缺陷小鼠生精过程出现障碍，导致不育。结合转录组学及甲基化测序分析，该项研究发现了ClpP或ClpX的缺失会引起mTORC1通路的过度激活，为研究线粒体质量调控基因在精子发生中的作用提供了新的证据和见解。

　　香港大学深圳医院博士后郭晨曦为该项研究的第一作者及共同通讯作者，香港大学深圳医院生殖医学科副顾问医生、副研究员王天任为该项研究的通讯作者，该研究获得了国家自然科学基金，深圳市孔雀团队基金，深圳市科技创新基金等项目的支持。

　　通讯作者简介：王天任，现任香港大学深圳医院生殖医学中心副顾问医师，副研究员，香港大学荣誉助理教授，博士后联合培养导师，深圳市海外高层次人才。研究方向：卵巢老化、早衰，胚胎发育，女性生育力保存。毕业于北京大学，随后在美国耶鲁大学生殖医学中心完成博士后研究。从事生殖内分泌和人类辅助生殖技术医疗和科研工作多年，研究方向为线粒体及卵巢老化、女性生育力保存和胚胎着床后发育等，相关研究承担2项国家自然科学基金，发表SCI论著20余篇。